| データタイトル | 他機関での菌株情報 | 遺伝子型 | 復元液 | データID | 菌株番号 | カタログURL | 生物種名 | 生物種名（著者名含） | 基準株 | 来歴 | 分離源 | 分類 | 培養温度 | 培養培地 | 親株（変異株の場合） | 付加情報 |
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解析情報 その他データ
| データID | ANAS0000302010273 |
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| データタイトル | データ（アルカロイド生産関連遺伝子の検証(実験種別：Data Analysis)） |
| 実施機関名 | 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 |
| 概要 |
Data Analysis, 植物アルカロイド（レチクリン）合成に必要なジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド (3,4-DHPAA) に注目し、人工代謝経路設計ツールを用いて人工代謝経路を設計し、大腸菌内で機能させ最終的にレチクリンを生産させる酵素のスクリーニングのLCMS計測結果
レチクリン生産試験 組換え体を、プレーティング、コロニーを複数含め、前培養、前培養液のOD600値を基に、OD600 = 0.05となるように培養液を抗生物質入り30 mL-TB培地 in 250-mL容バッフル付きフラスコに植菌し、25℃・150 rpm（回転）・15時間培養する。その後、0.1 M IPTG（終濃度300 µM）、50% グルコース（終濃度3%）を添加し培養を続ける（ドーパミンを添加する実験では1 M ドーパミン（終濃度5 mM）を同時に添加する）。各実験で設定した誘導時間後、培養液をサンプリングしLC/MS分析に供する。 , 大腸菌遺伝子組換え株, サンプリングした培養液をミリQ水で希釈した後、Nanosep®フィルター（0.45 µm、Pall Corporation）でろ過したものを分析サンプルとする（3,4-DHPAA oximeの確認実験では20倍希釈、それ以外の実験では50倍希釈、遠心は14,000 *g・3分間）。 質量分析計はトリプル四重極型LC/MS/MSシステム LCMS-8050（島津製作所）で行った。クロマトグラフ分離法は、４０℃で維持したKinetex Polar C18, 2.6 µm, 2.1×150 mmL (Phenomenex)で行った。質量分析の測定は、エレクトロスプレー法（ESI）を用いた正イオンモード、SIM/MRMモードで検出を行った。 レチクリンを定量する際は、標準品(S)-Reticuline（Santa Cruz Biotechnology）をミリQ水で段階希釈して標準溶液を調整し、その分析結果から描いた5点検量線を基に濃度を算出する。, ・LCMS-8050（島津製作所） ・Kinetex Polar C18, 2.6 µm, 2.1×150 mmL (Phenomenex), (S)-Reticuline(Santa Cruz Biotechnology） DOPAL(Santa Cruz Biotechnology） 3,4-dihydroxyphenylpyruvic acid(Ark Pharm, Inc.) ドーパミン塩酸塩 (東京化成工業株式会社) L-チロシン(東京化成工業株式会社) 4-Hydroxyphenylpyruvic Acid (東京化成工業株式会社) Tyramine(東京化成工業株式会社) |
| 実施日 | 2019-03-29 |
| URL | |
| ダウンロード | |
| ファイルの名前 | アルカロイド組み換え体LCMS測定結果.xlsx |
| ファイルの説明 | NBRC株アルカロイド組み換え体のLCMS測定結果まとめ |
| 関連情報 |
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