バイオテクノロジー

NBRCニュース 第49号

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                      NBRCニュース No. 49(2018.2.1)
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 NBRCニュース第49号をお届けします。今号はNBRCユーザーの方々から利用例をご紹介い
ただく連載「あなたの活用例教えてください」をお届けします。また前号に引き続き短期
連載として、カルタヘナ法の新しい確認制度について紹介します。最後までお読みいただ
ければ幸いです。

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 内容
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 1.新たにご利用可能となった微生物株
 2.あなたの活用例教えてください(4)
    環境中から分離した産膜酵母の酢酸塩耐性
 3.カルタヘナ法 ~新しい確認制度(鉱工業利用)について~(2)
    包括確認制度の内容について
 4.MALDI-TOF MS微生物同定用ライブラリーの提供について
 5.年度切替作業によるNBRC微生物株・DNAリソースの発送休止について
 6.NITEバイオテクノロジーセンター展示のお知らせ
 7.NBRCへご寄託いただく微生物などの利用条件を寄託者が選択できるようになります

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 1.新たにご利用可能となった微生物株
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◆ NBRC株、ゲノムDNA
 酵母 9株、糸状菌 8株、細菌 79株、アーキア 4株、微細藻類 1株が新たにご利用可能
となりました。
 細菌では、過去に特許寄託されていたアフラトキシン汚染を防除するBacillus subtil-
is NBRC 113158 (= FERM BP-1580)とNBRC 113159 (= FERM BP-1581)を公開しました。ま
た農薬のアラクロールを分解するMassilia chloroacetimidivorans NBRC 112463を公開し
ました。

【詳細】 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/nbrc/new_strain/new_dna.html

◆ RD株
 野外で採取したきのこから分離したキクラゲ属33株を追加しました。是非、リストをご
覧ください。

【詳細】 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/rd/new_rd.html
【RD株リスト】 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/rd/available_rd_list.html


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 2.あなたの活用例教えてください(4)
   環境中から分離した産膜酵母の酢酸塩耐性                  
                  (北見工業大学 准教授(技術士)小西 正朗)
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1. はじめに
 CO2増加による地球温暖化の懸念から、化石資源を原料としない燃料や基幹化学物質の
製造方法が研究されています。食料と競合しない木質バイオマスは原料として特に注目さ
れていて、木質バイオマスを糖化し、生物反応を駆使してバイオ燃料やバイオ材料を製造
することを目的とした多くの研究が世界各地で進行しています。リグノセルロース系バイ
オマスは、結晶化したセルロースとそれらを束ねる役割をするアラビノキシランならびに
接着剤の役割を果たすリグニンにより構成されているため、これらを糖化する過程には、
酸やアルカリによる処理や熱処理などの過酷な物理化学的な処理とセルラーゼを用いた酵
素糖化を組み合わせる方法がよく検討されています。この処理過程で、糖の過分解による
フルフラール類やギ酸の生成、アラビノキシランの側鎖であるアセチル基由来の酢酸の遊
離、リグニンの分解によるフェノール性物質の生成が同時に進行します。これらの物質
は、微生物の増殖や代謝を阻害することが知られているため、阻害物質の副生成を抑える
とともに、微生物の耐性の付与が必要とされています。筆者らは、環境中からこれらの物
質に耐性を持つ微生物を分離し評価しています。分離株を評価する際、NBRC保存株は比較
対象として重要な役割を果たしております。新しい酢酸塩耐性を示す菌の分離例とNBRC保
存株との比較実験の一例を解説したいと思います。
図1. リグノセルロース系バイオマス糖化液に含まれる阻害物質
      図1. リグノセルロース系バイオマス糖化液に含まれる阻害物質
        (濃度はコーンコブ糖化液中の濃度を示している)

2. 酢酸塩耐性酵母のスクリーニング
 リグノセルロース系バイオマス糖化の際に発生する、酢酸塩を含む複数の阻害物質に対
して耐性の高い酵母を分離するため、トウモロコシの芯を3.0%(w/v)の硫酸で熱処理
後、セルラーゼ製剤を用いて糖化した糖化液を培地として用いて、酵母を分離したとこ
ろ、数種類のサンプルから酵母様細胞の増殖が認められました。分離したKS47-1株(NITE 
P-02257)は、リボゾームRNAの遺伝子配列に基づく系統解析ならびに形態観察、生理学試
験により、ワインのオフフレーバーの原因酵母として知られる産膜酵母Pichia membrani-
faciensと同定されました。次に、この特異な耐性機能は、Pichia属共通の性質か、もし
くはP. membranifaciensの種特有か、もしくは株特異的なものかを推定する必要がありま
した。そこで、NBRCに寄託されている同種や近縁種の基準株(P. membranifacience NBRC 
10215P. manshurica NBRC 10726P. kluyveri NBRC 1165P. deserticola NBRC 
10716)と比較検討をしました。その結果、近縁種や基準株は糖化液中で増殖することがで
きないことがわかりました。つまり、糖化液中で増殖できる特性はKS47-1株に特異的な性
質であることがわかりました。また産膜酵母であるKS47-1株は、酢酸塩に顕著な耐性を示
し、フルフラールやヒドロキシメチルフルフラール、ギ酸などに対して、出芽酵母より高
い耐性を示すことがわかっています。これらの結果を踏まえ、リグノセルロース系バイオ
マスの糖化液中で既存の酵母よりロバストな条件で微生物反応が可能な酵母株として、
KS47-1株を特許出願しました(1)。微生物特許の出願には、通常の寄託もしくは特許微生
物寄託センターへの寄託が必要となります。詳しくは過去のNBRCニュース短期集中連載:
特許微生物寄託のイロハでも解説されていますので、バックナンバーを参照ください。
 環境中から微生物を分離した際、分類学的性質のみならず機能的性質を性格付ける必要
がありますが、多くの場合、比較対象株が必要になります。つまり、分類系統について
は、リボゾームRNAをバーコードとした分類手法が一般化され、DNA Databankが整備され
たことから、対象菌株を必要とする生理学実験を行なうことが少なくなっていますが、機
能を検証するためには、比較検討が必須となります。また、権利化の際、権利の範囲を明
確にする必要があります。今回のように株レベルでの特徴なのか、種や属レベルでの特徴
なのかを判定することは、非常に重要です。
 著者らは、KS47-1株を特異な阻害物質耐性を持つ微生物宿主として活用するため、遺伝
子組換え系の構築を検討しています。遺伝子組換え系が構築できれば、合成生物学的手法
(2)を用いて、異種生物の遺伝子を活用し、有用物質を生産する代謝経路を付加できるの
で、バイオマスの効率的な利用が可能な細胞工場を構築できると考えています。また、
KS47-1株の耐性関連遺伝子を活用するため、耐性メカニズムについて解明を試みていま
す。
          図2. KS47-1の微分干渉顕微鏡写真
           図2. KS47-1の微分干渉顕微鏡写真

【文献】
 (1) 小西ら,特願2016-116160,「発酵阻害物質への耐性を有する新規ピキア属酵母」
 (2) Keasling J.D. (2010). Science, 330, 1355-1358.

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 3.カルタヘナ法 ~新しい確認制度(鉱工業利用)について~(2)
   包括確認制度の内容について                 (小杉みどり)
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 前号のNBRCニュース第48号で、遺伝子組換え生物の産業利用(経済産業省所管分野)に
おける新しい確認制度「包括確認制度」開始の背景と概要について紹介しました。本制度
は、平成30年1月11日から開始しています。今号では、具体的な制度の内容について紹介
します。
 既存の制度(個別確認制度)では、遺伝子組換え生物ごとに大臣の確認を受ける必要が
あります。例えば、過去に大臣確認を受けた遺伝子組換え生物から、宿主とベクターを変
更せずに挿入遺伝子(供与核酸)を一部改変するだけでも、新たに申請して大臣の確認を
受けなければいけません。しかし、宿主とベクターが特定され、供与核酸の性質が一定の
範囲内であれば、執るべき拡散防止措置の特定が可能です。そのため今回新たに加わった
包括確認制度では、経済産業省が定める包括申請の対象範囲に入る供与核酸を包括的に扱
うこととし、申請時点では供与核酸を特定せずに、宿主とベクターおよび執るべき拡散防
止措置(設備や生産フロー、管理体制等)については、従来通り具体的な情報を申請しま
す。大臣確認後は、使用する供与核酸が包括申請の対象範囲であることを事業者自身で判
断して使用することになります。つまり、包括申請の大臣確認を受けた後は、その申請の
範囲内であれば自社判断で、すぐに生産を開始できます。
 包括申請の対象範囲は(1)「遺伝子組換え生物等の第二種使用等のうち産業上の使用
等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」の第7条で定めている申請書の備考
17aのGILSP区分の拡散防止措置で使用できる遺伝子組換え微生物(病原性がないもの)で
あること、(2)供与核酸の由来生物が、動植物、ヒト又は微生物(バイオセーフティレ
ベルがBSL1であるものに限る)であって、生成物の機能が病原性や毒性等に関係しないも
の、となっています。カテゴリー1区分の拡散防止措置が必要な遺伝子組換え微生物や、
宿主が動植物の場合は、現在対象となっていません。また、包括申請を行うことができる
事業者の要件として、申請実績や安全管理体制の整備など、いくつかの条件があります。
詳しくは経済産業省が公開している「包括申請における拡散防止措置の確認について(通
知)(20171220商局第1号)」をご確認ください。
 申請の手続きについては、今までどおり、産業利用二種省令に定められた様式での申請
になりますが、申請書の審査方法や確認を受けた後の対応において、個別確認の場合とは
以下の点で異なります。

◇審査の手続き◇
 申請書の審査に当たっては、書類での審査に加え、経済産業省が必要と判断した場合に
は事前の現場確認による審査を行います。現場の確認は、あらかじめ日程を調整した上で
経済産業省及びNITEの職員が行います。

◇事業者での供与核酸の判断◇
 包括確認を受けた後、遺伝子組換え微生物を産業利用するときは、生産前に事業者の安
全委員会において審議官通知の別紙に添付されている「供与核酸の判定指針」に従って事
業者自身で使用の適否を判断します。事業者の安全委員会で基準を満たすと判断された供
与核酸については経済産業省への事前の申請なしに使用できます。

◇年度末の報告◇
 包括確認を受けた後は、毎年度末に、経済産業省に使用実績(使用の有無、使用した供
与核酸など)について報告する必要があります。

 詳しくは、経済産業省から発行された「包括申請における拡散防止措置の確認について
(通知)(20171220商局第1号)」及び「第二種使用に係る大臣確認手順及びチェックリ
スト(お知らせ)」をご確認ください。申請方法や申請書の記載方法についてはNITEの
ウェブページで公開しています。なお、従来の個別の申請も引き続き受け付けています。
どちらの制度に基づいた申請がよいかなどについてのご相談も受け付けていますので、包
括申請にご興味のある方はNITEバイオテクノロジーセンター国際事業推進課安全審査室ま
でお気軽にお問い合わせください。

【経済産業省 カルタヘナ法に関するページ】
 包括申請に関する通知やお知らせはこちらで確認することができます。
http://www.meti.go.jp/policy/mono_info_service/mono/bio/cartagena/anzen-shinsa2.html

【NITEカルタヘナ法事前審査のページ】
 NITEへの事前審査に関する情報はこちらで確認することができます。申請書記載マニュ
アルもありますので、併せてご覧ください。
https://www.nite.go.jp/nbrc/cartagena/houkatsu.html

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 4.MALDI-TOF MS微生物同定用ライブラリーの提供について
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 マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF MS)を用
いた微生物の迅速同定技術は多くの利点があり、この10年で急速に普及が進んでいます。
この方法は、微生物毎のMALDI-TOF MSマススペクトルを取得し、指紋判定法により種レベ
ルもしくはそれ以下のグループを識別・同定する方法です。このためには、比較参照とす
るマススペクトルデータのライブラリーが欠かせませんが、産業有用微生物についてのラ
イブラリーが不足している状況です。
 このたび私達は、微生物の安全かつ適切な産業利用を支援するために、NBRCが保存・提
供している微生物を中心に、環境汚染物質分解機能を有する菌群および食品産業に重要な
菌群と、それらと区別しづらい日和見感染菌について、MALDI-TOF MSによるマススペクト
ル・ライブラリーを構築し、2017年12月15日から提供を開始しました。
 第一弾としてシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)類縁菌、乳酸菌(Lacto-
coccus spp.、Leuconostoc spp.)、ノカルディア(Nocardia)属、黄麹菌(Aspergillus
oryzae)近縁種の各ライブラリーを公開しました。菌群ごとに、MALDI Biotyper®(ブ
ルカー)用の株単位のデータライブラリーとSARAMISTM(ビオメリュー&島津製作所)
用のSuperSpectraのデータライブラリーがあります。費用は無料ですので、是非ご利用く
ださい。

【詳細】 https://www.nite.go.jp/nbrc/industry/maldi.html

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 5.年度切替作業によるNBRC微生物株・DNAリソースの発送休止について
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NBRCでは下記の期間中、NBRC微生物株・DNAリソースの発送を休止させていただきます。

 発送休止期間:平成30年3月28日(水)~30日(金)

 発送予定:
  3月23日(金)まで受付分 → 3月27日(火)発送
  3月24日(土)~29日(木)まで受付分 → 4月2日(月)以降順次発送

 ※分譲受付が集中する場合や分譲標品の形態により、上記の発送日以降になることがご
  ざいます。

【詳細】 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/information/holiday_2017.html

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 6.NITEバイオテクノロジーセンター展示のお知らせ
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 以下に出展いたします。ブースではお立ち寄りいただいた皆様からのご相談やご質問に
もお答えします。是非お越しください。

日本農芸化学会2018年度大会 附設展示会
 日時:平成30年3月16日(金)~18日(日)
 場所:名城大学 天白キャンパス 体育館
    http://www.jsbba.or.jp/2018/
 MALDI-TOF MS微生物迅速同定ライブラリーや微生物有害性遺伝子情報データベース
(MiFuP Safety)等の紹介をします。

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 7.NBRCへご寄託いただく微生物などの利用条件を寄託者が選択できるようになります
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 生物遺伝資源の利用を促進するため、NBRCでは産業上有用な株、論文発表株などの寄託
を受けています。この度、寄託者がNBRCへ寄託する微生物の利用条件を選択できるように
制度を変更します。選択できる条件は以下の通りです。

(1)利用目的の制限無し
(2)利用目的は非商業的利用に限定、ただし寄託者へ事前通知すれば商業的利用が可能
(3)利用目的は非商業的利用に限定、商業的利用には寄託者との事前合意が必要
(4)利用目的は非商業的利用に限定(原産国の法令等により生物遺伝資源の商業利用が
   禁止されている場合に限ります)
(5)利用条件は寄託者が指定(NBRCが受け入れられない条件があります)

 従来の「制限付き寄託」のように寄託株の商業利用を把握されたい場合は、上記(2)
あるいは(3)の条件をお選び下さい。
 寄託時に利用条件を設定する制度とあわせて、NBRC株として寄託する際の同意書やNBRC
株の分譲を受ける際の同意書を改訂しますので、利用条件が明確になり、より安心してご
利用いただけるようになります。新しい寄託制度は近日中の開始を予定しています。詳細
は新制度の開始に合わせてウェブページでお知らせします。ご質問等はnbrc@nite.go.jp
までお気軽にお問合せください。

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 編集後記
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 平昌オリンピックまであと僅かとなりました。みなさまは注目している競技はあります
か?私は学生時代にスキーばかりしており、その頃からフリースタイルスキー(モーグル
やエアリアルなど)というマイナーなカテゴリーの競技が大好きになりました。あまり知
られていないかもしれませんが、今回は男子モーグルに有力な選手が多くいるので個人的
には期待しています。冬季オリンピックは夏季オリンピックと比べると地味な印象になっ
ているのが残念ですが、メダルを獲得して日本を盛り上げてほしいです。(MH)

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 ・画像付きのバックナンバーを以下のサイトに掲載しております。受信アドレス変更、
  受信停止も以下のサイトからお手続きいただけます。
  https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/others/nbrcnews/nbrcnews.html
 ・NBRCニュースは配信登録いただいたメールアドレスにお送りしております。
  万が一間違えて配信されておりましたら、お手数ですが、下記のアドレスにご連絡
  ください。
 ・ご質問、転載のご要望など、NBRCニュースについてのお問い合わせは、下記のアド
  レスにご連絡ください。
 ・掲載内容は予告なく変更することがございます。掲載内容を許可なく複製・転載さ
  れることを禁止します。
 ・偶数月の1日(休日の場合はその前後)に配信します。第50号は2018年3月30日に配信
  予定です。

  編集・発行
    独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)バイオテクノロジーセンター
    NBRCニュース編集局(nbrcnews@nite.go.jp)
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お問い合わせ

独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター  生物資源利用促進課
TEL:0438-20-5763  FAX:0438-52-2329
住所:〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 地図
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