NBRCニュース　第１０１号

野田産研における破壊株の作製
   野田産研では「ku70」というNHEJ関連遺伝子を破壊し遺伝子破壊を行いやすくした黄麴菌が開発されました(4,5)。それを受けて麴菌の染色体工学を試みる生物系特定産業技術研究支援センター (生研支援センター)のプロジェクトが 2005 年から開始されました。その一環として、遺伝子破壊株の網羅的作製がスタートし、破壊するターゲットとして転写制御関連因子 (TF) の遺伝子が選ばれました。なぜTFであったかというと、TFは関連する複数の遺伝子を同時に制御しているため、破壊した場合に表現型の変化が表れやすいと考えられたからです。破壊するTFとしては、まず典型的な転写制御因子であるZn₂Cys₆ binuclear cluster タンパク質（注2）のようなDNA 結合タンパク質が選抜されました。また、クロマチン修飾因子（注3）などDNA結合タンパク質以外でも広範囲な遺伝子発現制御に関与する因子も破壊の対象としました。生研支援センターのプロジェクトは 2010 年に終了しましたが、その後も野田産研では破壊株作製を続け、最終的に400株を超える破壊株を得ることができました。ただし、標的遺伝子が生育に必須な場合は、破壊株が得られないものやヘテロカリオン（注4）の株しか得られないものもありました。

東北大学における破壊株の作製
   東北大学では2018年10月に野田産研の支援を受けて発酵微生物学寄附講座が開設され、寄附講座の研究業務の一環として、野田産研で作製された遺伝子破壊株ライブラリの保管と分譲作業を行うとともに、TFのうち破壊が試みられていない約200個について破壊株作製を進めました。この時に使用した宿主株は、NHEJ経路の最終段階で機能するDNAリガーゼLigDの遺伝子を破壊した株です(6)。そして結果的には、TFについて野田産研作製の株と合わせて約600株の遺伝子破壊株が得られました（上でも述べたようにヘテロカリオンの株しか得られなかった遺伝子もあります）。TFに加えてさらにプロテインキナーゼ（PK）、プロテインホスファターゼ（PP）、ユビキチンリガーゼ（UL）の遺伝子についても網羅的な破壊株作製を試みました。これらの酵素は生命機能の制御に大きく関わっていることが知られているので、TFと同じように破壊することで表現型に変化が表れることが期待されたことから、次の破壊のターゲットとして選ばれました。PKは約130、PPは約40、ULは約60、の遺伝子を選抜し、破壊株を作製しました。ただ、生育に必須な遺伝子が多く存在しており、ヘテロカリオンの株しか得られないものがいくつかあります。

   なお、破壊対象としたTF、PK、PP、ULの遺伝子はゲノム解析によって予測された遺伝子モデルのアノテーション（注5）などを参考に選抜したものであり、麴菌ゲノム中に存在するそれらに関するもの全てを網羅できているわけではないことをあらかじめお断りしておきます。

破壊株ライブラリの使用例
1) 野田産研における使用例
   黄麴菌では分生子形成制御に関わる遺伝子の多くが未解明でしたが、本ライブラリには複数の分生子形成不全株があったためそれらを解析し、黄麴菌の分生子形成制御系の主要な部分を解明しました(7)。また、破壊株の中に菌核形成（注6）が旺盛な株が存在しており、解析の結果、分生子形成の初期過程に関与することからEcdRと名付けられた転写因子を見出しました(8)。さらに、黄麴菌は多糖類の一種であるマンナンを分解できますが、その分解系の制御因子は未知でした。そこで本ライブラリを用いたマンナン分解で生じるハロ（消化円）を指標としたプレートアッセイを行い、マンナン分解系の制御因子である ManR を見つけました(9)。

2) 東北大学における使用例
   麴菌の醸造における最も重要な役割は、デンプン分解酵素やタンパク質分解酵素の生産です。日本酒製造ではデンプン分解酵素のうちグルコアミラーゼがグルコース生成に重要ですし、醬油や味噌製造ではプロテアーゼやペプチダーゼなどのタンパク質分解酵素が必要です。これらの酵素の多くは液体培養ではあまり生産されずに、固体培養で大量に生産されます。この固体培養特異的に生産される酵素の生産制御に関わる転写因子を探索するために、固体培養を模した寒天培地を用いてグルコアミラーゼB（GlaB）の生産を指標にしたプレートアッセイにより本ライブラリをスクリーニングした結果、FlbCという転写因子を見出しました(10)。

   今回NBRCで分譲が開始されたライブラリは、研究用途に限定せず商業利用も可能なものとなっています。本ライブラリが我が国の発酵産業の益々の発展に役立つことを強く願っております。

麴菌遺伝子破壊株ライブラリはNBRCのこちらのページから購入できます。
https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/disruptant_library/index.html

注釈
注1）非相同末端結合（non-homologous end joining; NHEJ）／相同組換え（homologous recombination; HR）：
NHEJはDNA断片を染色体へランダムに組み込む修復方法。HRは既存のDNA配列と似た部分を利用して正確にDNAを入れ替える方法。黄麴菌では目的の遺伝子破壊にNHEJの働きを抑え、HRを促進する必要があった。

注2）Zn₂Cys₆ binuclear cluster タンパク質：
DNAに結合して遺伝子発現を調整するカビや酵母に特徴的な転写因子の一種。亜鉛とシステインにより構成されるコンパクトな立体構造（クラスター）を持っており、これがDNAとの結合に関与する。

注3）クロマチン修飾因子：
DNAには直接結合せず、周囲のクロマチン構造を変化させ、広範囲に遺伝子発現を制御する因子。遺伝子破壊の対象にもなった。

注4．ヘテロカリオン：
黄麴菌は細胞内に複数の核をもつ「多核」の生物である。１つの細胞内に、異なる遺伝子型の核（正常核と破壊核）が共存する状態をヘテロカリオンと呼ぶ。一方、同一の遺伝子型の核（破壊核）のみを持つ状態はホモカリオンと呼ばれる。生育に必須な遺伝子の破壊株を作製しようとすると、全ての核の対象遺伝子が破壊されたホモカリオンは生育できず、正常核と破壊核が混在したヘテロカリオンだけが生育する。

注5．遺伝子モデルのアノテーション：
ゲノムを解析し、遺伝子の位置や機能を予測して説明を付ける作業。本ライブラリ作製では、その予測に基づき破壊対象遺伝子を選抜したが、同じ機能を持つ遺伝子だとしてもアノテーションされていないために選抜されなかったものが存在する可能性がある。

注6）菌核形成／EcdR：
黄麴菌は通常分生子を形成して増殖するが、ある生育条件下では菌核（菌糸が凝集してできた特殊な構造。黄麴菌の祖先に有性生活環があったころの名残という説もある）を多く作ることがある。野生型株では分生子を形成する培養条件で菌核形成が旺盛な株を解析した結果、分生子形成初期を制御する転写因子EcdRを発見した。

参考文献
(1)  https://www.jozo.or.jp/gakkai/wp-content/uploads/sites/4/2020/02/koujikinnituite2.pdf
(2)  Machida, M. et al. (2005) Nature, 438, 1157–1161.
       DOI: 10.1038/nature04300
(3)  Ninomiya, Y. et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA, 101, 12248-12253.
       DOI: 10.1073/pnas.0402780101
(4)  Takahashi, T. et al. (2006) Biosci Biotechnol Biochem, 70, 135-143.
       DOI: 10.1271/bbb.70.135
(5)  Takahashi, T. et al. (2006) Mol Gen Genomics 275, 460-470.
       DOI: 10.1007/s00438-006-0104-1
(6)  Mizutani, O. et al. (2008) Fungal Genet Biol 45, 878-889.
       DOI: 10.1016/j.fgb.2007.12.010
(7)  Ogawa, M. et al. (2010) Fungal Genet Biol 47, 10–18.
       DOI: 10.1016/j.fgb.2009.10.004
(8)  Jin, F. et al. (2011) Fungal Genet Biol 48, 1108–1115.
       DOI: 10.1016/j.fgb.2011.10.001
(9)  Ogawa, M. et al. (2012) Fungal Genet Biol 49, 987–995.
       DOI: 10.1016/j.fgb.2012.09.006
(10)  Tanaka, M. et al. (2016) Appl Microbiol Biotechnol 100, 5859–5868.
       DOI: 10.1007/s00253-016-7419-6