NBRCニュース　第９４号

   糸状菌では、節足動物の腸の中と外（排泄物や死骸など）で異なる形態で生活する「腸内外両生菌類」のUnguispora grylli NBRC 116289^T、NBRC 116287、NBRC 116288、NBRC 116290を公開しました。この菌類の発見が、菌類の陸上進出の進化過程の解明につながると期待されています(1,2)。

   細菌では、ツムギアリ腸管から分離されたFormicincola oecophyllae NBRC 113640^T、NBRC 113639や、韓国土壌由来の耐放射線細菌"Spirosoma aureum" NBRC 114506^T、"Hymenobacter russus" NBRC 114380^Tを公開しました(※)。

※国際原核生物命名規約に基づき、正式に承認されていない学名は、引用符を付けて表記しています。

【新たに分譲を開始した微生物資源】
https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/nbrc/new_strain/new_dna.html

【参考】
（1）https://www.tsukuba.ac.jp/journal/biology-environment/20221011141500.html
（2）https://msc.tsukuba.ac.jp/news20250716

   皆様は「藻類」と聞くと、何が思い浮かぶでしょうか。身近な食で考えますと、ご飯のお供に欠かせない海苔やお味噌汁の具材、出汁取りに使う昆布、これからの季節のちょっとした甘味である心太（ところてん）、といった海藻由来のものが思い浮かぶかもしれません。このような肉眼で確認できるサイズの藻類は、一般に「大型藻類」と呼ばれています。

   一方で、数µmから数百µm程度（1 µmは1 mmの1000分の1）の大きさで、肉眼では確認しにくい藻類は「微細藻類」と呼ばれています。こちらには葉緑体を含んだ緑色の体をもち、かつ運動性を有した淡水生のミドリムシ（ユーグレナ／Euglena）やボルボックス（Volvox）などが含まれます。学校の授業でご覧になったことがあるかもしれません。

   このように、「藻類」は、大きさ、生息環境、運動性などにおいて実に多様であり、分子系統学的にも複数の異なる分類群に分かれています。こうした多様性は、藻類が産生する代謝産物の幅広さにも反映されています。なかでも微細藻類は、栄養素や有用成分だけでなく、バイオ燃料となる油脂を産生することでも注目されています。

   例えば、冒頭に挙げたミドリムシは、体内でビタミンやミネラル、不飽和脂肪酸などの栄養素を産生し、健康食品、サプリメント、飼料や肥料として商品化されています。さらに、油脂を産生する性質を活かして、持続可能な航空燃料（Sustainable Aviation Fuel; SAF）の原料としての開発も進められています。

   このようなバイオジェット燃料の分野では、同じく高い油脂蓄積能をもつ微細藻類であるボツリオコッカス（Botryococcus）の研究も日本で進められており、こちらも実用化が期待されています。

   このほかにも、抗酸化作用をもつアスタキサンチンを産生するヘマトコッカス（Haematococcus）、エイコサペンタエン酸（EPA）を豊富に含むナンノクロロプシス（Nannochloropsis）など、人類にとって有用な成分を有する微細藻類も知られています。微細藻類は、まさに多様な利用価値を秘めた「資源の宝庫」といえるでしょう。
 
   次世代シーケンサー（NGS）を用いた微生物叢（そう）の解析においては、解析結果の精度を確保するうえで、信頼性の高い標準試料の使用が有効です。NBRCでは、複数種の微生物を定めた比率で混合した「NBRC微生物カクテル」を標準試料として提供しています。この標準試料の品質を高めるには、構成する各細菌の細胞数を正確に測定することが求められます。
   NBRCは、この目的のために、細菌の細胞数を高精度に定量できる「アデニン-HPLC法」を用いています。本稿では、この測定法の概要について紹介します。

◇腸内フローラの解析とその課題
   “腸活”などの言葉もあるように、腸内フローラ（腸内微生物叢）が健康に密接に関わっていることはよく知られています。今や、腸内微生物叢を調べる検査キットが市販され、食事や生活習慣へのアドバイスも行われています。こうした解析の多くは、NGSというDNA配列解読技術によって行われていますが、NGS解析には様々な手法が存在し、同じ微生物叢を調べても、結果に差が生じることが問題視されています。医療分野でもNGS解析の臨床応用が模索されており、解析の精度と信頼性を高めることが大きな課題となっています(1)。

◇解析精度を高めるカギ － 標準試料の重要性と品質確保
   NGS解析の精度を検証・比較するには、計測用の標準試料を用いることが有効です。そこで、NBRCでは、対象とする微生物叢に合わせて約20種の細菌またはDNAを等量ずつ混合した標準試料を作製し、NBRC微生物カクテルとして提供しています。いずれの標準試料も精度の高い調製が求められますが、特に、複数種の細菌を混合した標準試料では、その品質を確保するために、細胞数を正確に測定する必要がありました。

◇従来の菌数測定
   従来の顕微鏡観察、フローサイトメーター（染色した細菌を非常に細い管に流し、一つ一つの細胞を数える装置）、リアルタイムPCRなどによる測定では、細胞の形や大きさのバラつき、凝集（くっつき合い）、DNA抽出や増幅効率の違いといった要因の影響で、正確に細胞数を数えることは困難です。

◇アデニン-HPLC法による正確な菌数測定
   そこで我々が導入したのが「アデニン-HPLC法」です。この方法は、DNAを構成するアデニン量をHPLCで測定し、それをもとに細胞数を計算します(2, 3, 4)。操作のばらつきや微生物種の違いに左右されにくく、安定性と再現性に優れている点が特徴です。

【アデニン-HPLC法の手順と原理】
＜ステップ1：アデニンの測定＞
   細菌の細胞を塩酸で加熱処理（0.2 N、60ºC、1時間）することにより、DNA中のアデニンとグアニン（プリン残基）が細胞外へ溶出されます（図1）。このうち、より定量しやすいアデニンのみを対象として、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)でその量を正確に測定します。

＜ステップ2：総DNA量の算出＞
   測定したアデニン量と、対象細菌のゲノム情報から求めた全DNA中に占めるアデニンの割合にもとづき、チューブ内に含まれる総DNA量を算出します（図1 ①）。

＜ステップ3：細胞数の算出＞
   次に、対象細菌1細胞あたりのDNA量をゲノム情報から理論的に求めます（図1 ②）。ステップ2で算出した総DNA量（図1 ①）を、この「細菌1細胞あたりのDNA量（理論値）」（図1 ②）で割ることで、チューブ内に含まれる細菌細胞数（ゲノム数）を導き出すことができます。

   アデニン-HPLC法を用いることで、標準試料を正確に調製することが可能となりました。計算の詳細や前提条件については、Tourlousseら(2)および大山ら(4)に詳しく記載されていますので、関心のある方はそちらをご参照ください。

◇高品質なNBRC微生物カクテルの提供
   NBRC微生物カクテルは、研究目的や微生物叢の特徴に応じて3種類のラインナップを用意しております。興味を持たれた方はぜひ以下のサイトをご覧ください（https://www.nite.go.jp/nbrc/industry/microbiome/index.html）。