バイオテクノロジー

NBRCニュース 第54号

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                      NBRCニュース No. 54(2018.12.3)
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 NBRCニュース第54号をお届けします。今号は連載「微生物あれこれ」にて、NBRCにて実
施している微生物の有用工業化合物の産生能調査に関する成果をご紹介します。NBRC保有
菌株は宝の山かもしれない!?と期待してしまう結果となっております。また、前号に引
き続き「細菌・アーキアの生育の仕方から選ぶ保存方法」の連載も掲載しております。最
後までお読みいただければ幸いです。

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 内容
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 1.新たにご利用可能となった微生物株
 2.微生物あれこれ(47)
    スマートセルインダストリーの実現に向けたNBRCの取り組み
 3.細菌・アーキアの生育の仕方から選ぶ保存方法(1)
    グラム陽性・低GC細菌(Firmicutes門)
 4.NITE講座(後期)のご案内
    生物遺伝資源の産業利用によるバイオ・イノベーション
    ~微生物遺伝資源の産業利用促進~
 5.2018年度MALDI-TOF MS微生物同定ワークショップのご案内
 6.年末年始のNBRC株・DNAリソースの発送休止について

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 1.新たにご利用可能となった微生物株
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◆ NBRC株、ゲノムDNA
 糸状菌 11株、細菌 65株、アーキア 6株、微細藻類 3株、ファージ 7株、ゲノムDNA 4株
が新たにご利用可能となりました。

 糸状菌では、食品汚染・住環境等から分離された9菌株(NBRC 113339NBRC 113340NBRC 113341NBRC 113342NBRC 113343NBRC 113360NBRC 113361NBRC 113362及び
NBRC 113363)を公開しました。このうちNBRC 113360およびNBRC 113361はプラスチック製
ヘッドフォン、スルメから分離された好乾性菌で、糸状菌の培養で一般的に用いられるPDA
培地などではほとんど生育しません。抗カビ性試験を行う際に、実際に試験をする製品ま
たは食品に近い物から分離された菌株を使いたいという方におすすめです。
 細菌では、NITEが鉄腐食性機構を解明したメタン生成古細菌Methanococcus maripaludis
NBRC 103642、韓国のマッコリのスターターから分離された乳酸菌Lactobacillus nuruki 
NBRC 112011を公開しました。
 微細藻類では、油脂産生藻類の分譲を開始しました。これは、海洋バイオテクノロジー
研究所(MBI)(当時)で分離され、軽油をつくる微細藻類として報告されたCoccomyxa 
sp. (“Pseudochoricystis ellipsoidea”)で、今回2株(NBRC 112353 (MBIC11204)、
NBRC 112354 (MBIC11220))を公開します。この株はこれまでにもお問い合わせの多かっ
た株で、この度分譲が可能となりました。なお、これらの株は分譲の際に誓約書をご提出
頂く必要があります。

【メタン生成古細菌による鉄腐食性機構の解明に関するプレス発表】
 https://www.nite.go.jp/nbrc/information/release/20181022.html
【油脂産生藻類に関する参考文献】
 Satoh, A., et. al., (2010) J. Jpn. Inst. Energy. 89, 909-913.
【詳細】 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/nbrc/new_strain/new_dna.html

◆ RD株
 岩手県工業技術センターとの連携により、浄法寺漆の有名な産地であり日本一の生産量
を誇る岩手県二戸市の漆林で採取したウルシの樹皮や花、葉、土壌などを分離源とする微
生物164株(細菌148株、糸状菌16株)の提供を開始しました。乳酸菌や硝酸還元菌を含む
多様な菌種があります。器を腐敗から守り、抗菌性が報告されている漆に由来する菌株で
す。新たなスクリーニング源として是非ご利用ください。稀少なウルシ蜂蜜に由来する菌
株を含む酵母(約70株)についても今年度中を目処に提供を開始する予定です。

【詳細】 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/rd/new_rd.html
【RD株リスト】 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/rd/available_rd_list.html

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 2.微生物あれこれ(47)
   スマートセルインダストリーの実現に向けたNBRCの取り組み   (寺尾拓馬)
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 皆さんは、微生物が産生する化合物と聞いてどんなものが思い浮かびますか。抗生物質、
アミノ酸、ビタミン、色素といったような医薬品や食品に関連する化合物が多いのではな
いでしょうか。一方で、あまり知られてはいませんが微生物の中には合成ゴムやプラス
チックの原料となる物質を産生するものがいます。本稿では、現在、NBRCで取り組んでい
る工業原料物質を産生する微生物の探索についてご紹介いたします。
 2009年に経済協力開発機構(OECD)から提唱された“Bioeconomy”社会の実現や、国連
が定めた持続可能な開発目標(SDGs;Sustainable Development Goals)の達成に向けて、
欧米を中心にバイオ技術を活用した物質生産産業を推進する政策が打ち出されています。
国内においても経済産業省が主導するスマートセルインダストリー構想のもと、化石燃料
に依存しない工業プロセスの構築や化学合成では生産困難な有用物質の創製を目指して、
産官学が連携して研究開発を進めています。スマートセルインダストリーとは、ゲノム編
集技術やオミックス解析などを駆使し、遺伝子が高度にデザインされ、その発現も機能的
に制御された生物細胞「スマートセル」を用いた新しいバイオ産業のことを意味します
(1)。
 スマートセルを効率的に設計するためには、研究開発の基盤となる微生物のゲノム配列
や代謝系などに関わる情報が充実していることが必要です。しかし、地球上に存在すると
される多種多様な微生物のうち分離同定されている種はごくわずかであり、しかも情報が
付加されているものはさらに限られた種に留まっているのが現状です。
 このような状況を踏まえて、NBRCでは様々な微生物が有する有用工業化合物の産生能に
ついて調査することで、スマートセルインダストリーの要である代謝情報の整備に取り組
んでいます。具体的には、NBRCから提供している約90,000株のうち、バクテリアを中心と
した7門22綱45目90科162属745株(2018年12月1日現在)を対象に、ヘッドスペースガスク
ロマトグラフ質量分析装置(HS-GC/MS)を用いて一斉分析することで、NBRC株が産生する
化合物のデータ取得を行っています。分析方法を簡単に紹介しますと、1種類の菌株ごと
に、密栓したバイアル瓶を培養容器として用いて1週間ほど静置培養した後、HS-GC/MSで
気相成分を定性分析することで、各々の化合物の産生能を評価しています。本手法は、揮
発性化合物を分析対象とし、一般的なGC/MSや液体クロマトグラフ質量分析装置(LC/MS)
を用いた分析方法と比較して、菌体破砕・溶媒抽出・精製といった前処理が不要であるた
め、気相成分をハイスループットに分析できるのが利点です。
   表1 HS-GC/MS解析の対象微生物(2018年12月1日現在)

図1 HS-GC/MSを用いた分析手法の概要図
            図1 HS-GC/MSを用いた分析手法の概要図

 本事業では約80種類の化合物を対象に解析していますが、今回は特に産業上有用とされ
る化合物「イソプレン」をピックアップして紹介します。イソプレンは炭素数5の炭化水
素で、合成ゴムなどの原料として重要であり、工業的にはナフサや軽油を熱分解すること
で主に生産されています。イソプレンの生合成経路として、KEGG(2)およびBRENDA(3)
のデータベース上では、メバロン酸経路または非メバロン酸経路を経て合成されたジメチ
ルアリル二リン酸(DMAPP)を前駆体としてイソプレン合成酵素(Isoprene synthase, 
EC番号4.2.3.27)により合成される経路が植物で知られています。微生物では合成酵素や
経路は特定されていないもののBacillus subtilis ATCC 6051(=NBRC 13719)がイソプ
レンを産生することが報告されています(4)。一方、我々がNBRC株745株についてイソプ
レン産生能を調査した結果では、既知のB. subtilis NBRC 13719に加え、幅広い分類群の
菌株(バクテリア)で産生が確認されました。また、厳密な定量分析の結果ではありませ
んがB. subtilisよりも10倍ほど高い産生能をもつ菌株も複数確認されています。
 イソプレン以外の多数の化合物についても、NBRC株でその産生を確認しています。さら
に、その合成経路は遺伝子または酵素レベルで特定されていない例が複数確認されていま
す(5)。これらの結果は、微生物の新しい代謝経路が存在することを示していると同時
に、NBRCに保存されている多様な微生物は、未知の有用酵素や代謝経路を探索する上で
“宝の山”とも言える可能性を示唆しています。
図2 KEGG・BRENDAに基づくイソプレン合成経路図
         図2 KEGG・BRENDAに基づくイソプレン合成経路図

 今回紹介したNBRC株の物質産生能に関するデータは、無償で提供を行っています。解析
データにご興味をお持ちの方がおりましたらお気軽にご連絡ください。

【詳細情報・問い合わせ先】
 スマートセルインダストリー社会に向けた微生物資源の有効活用
 https://www.nite.go.jp/nbrc/industry/smartcell/smartcell.html
 ご連絡・お問い合わせはウェブページ下部の「お問い合わせフォーム」をご利用くださ
 い。

【参考文献】
(1)経済産業省(2016)バイオ小委員会中間報告書「バイオテクノロジーが生み出す新た
   な潮流〔スマートセルインダストリー時代の幕開け〕」
   http://www.meti.go.jp/press/2016/07/20160714001/20160714001.html
(2)Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.
   https://www.genome.jp/kegg/kegg.html
(3)BRENDA Comprehensive Enzyme Information System.
   http://www.brenda-enzymes.org
(4)Sivy, T.L., et. al. (2002). Biochem. Biophys. Res. Commun. 294, 71-75.
(5)寺尾ら、第70回日本生物工学会大会トピックス集、63-64.
 https://www.sbj.or.jp/2018/wp-content/uploads/file/top/2018/sbj2018_topics.pdf

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 3.細菌・アーキアの生育の仕方から選ぶ保存方法(1)
   グラム陽性・低GC細菌(Firmicutes門)            (宮下美香)
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 NBRCで保有するグラム陽性・低GC細菌(Firmicutes門)に含まれる全ての菌種は、凍結
保存法による長期保存が可能で、糸状菌や放線菌のように菌糸が寒天中にもぐりこむこと
がないため、寒天ごと切り出す必要はなく、菌体を凍結用保護液に分散させた懸濁液を調
製して保存します(参考:微生物の保存法(1)一般的な細菌の凍結保存法)。また、真
空乾燥保存法(L-乾燥保存法)も、一部のClostridiales目菌株や偏性嫌気性菌を除いて
適用可能です(参考:微生物の保存法(9)L-乾燥保存法-アンプルの作製)。そこで、
今回はFirmicutes門の、主に凍結保存法におけるコツや注意点について主要な分類群ごと
にご紹介します。
 なお、属種名から、その属種がどの目や科に属するかを調べる方法は、「細菌・アーキ
アの分類群から見た培養方法の選び方(0)~はじめに~」をご参照ください。

◆Bacillales目
 斜面培地や平板培地で培養した菌体は、白金耳などで容易に掻き取ることができます。
掻き取った菌体は凍結用保護液に移し、懸濁液を調製します。この時、粘性が高く塊にな
りやすい菌体でもしっかりと懸濁して細胞を均質に分散させることが大切です。液体培養
した場合は遠心分離して集菌し、保護液に懸濁するか、集菌せずに直接液体培養物にグリ
セロールを加えることで懸濁液を調製します。調製した懸濁液は繰り返しの使用を避ける
ため、少量ずつ小分けにして凍結します。
 胞子は乾燥や温度変化などに強く、栄養細胞よりも保存性が高いですが、芽胞形成菌種
であっても株によって、または培養条件によって胞子形成が悪い場合があります。
Bacillales目に含まれる芽胞形成菌種の多くは、栄養細胞であっても凍結保存に十分耐え、
適した状態で保存していれば復元時に菌数が激減することはありませんので、胞子形成率
が低い菌株の場合は無理に長期間おかず、フレッシュな栄養細胞の状態で保存する方が高
い生残率を期待できます。しかしBacillus属の一部(Bacillus subtilisBacillus
cereusなど)では、寒天培地表面に膜状に張り付いて生育し、培養の早い段階では白金耳
では掻き取れず十分な菌体量を回収出来ないことがあります。このような場合は、時間の
経過と共に溶菌が進んで強固な菌膜構造が壊れることを利用して、長期間おくことで容易
に掻き取れるようになるのを待ちます。ただし胞子が形成されていなければ、ただ死んで
しまうだけですので、必ず早い段階で胞子形成の有無を確認することが重要です。または
液体培地で激しく振とう培養することで、膜状になるのを防ぐことができます。
 Bacillales目に含まれながら、Thermoactinomycetaceae科の菌種は科名から推測される
とおり、まるで放線菌のように寒天に食い込んで生育します(NBRCで保有するのは
Laceyella属やMechercharimyces属、Thermoactinomyces属など)。このような場合は金属
製の硬い白金耳で寒天ごと掻き取るなど、菌糸は伸ばさないものの硬いコロニーを作るタ
イプの放線菌(グラム陽性・高GC細菌)と同じ取り扱いをします。
 凍結保存は、フレッシュな細胞を十分な菌濃度になるように懸濁液を調製することが大
切です。高温性など特に生育サイクルの早い株は集菌のタイミングを逃さないように、菌
体外物質の生産量が多い株などは見た目の濁度に対して菌数が少ない場合があるので惑わ
されないようにしてください。
◆Lactobacillales目
 通性嫌気的に平板培養した菌体は、上述したBacillales目の場合と同じように、白金耳
で掻き取って保護液に懸濁します。液体静置培養した場合は遠心分離により集菌して保護
液に懸濁します。乳酸菌は大量の酸を作るので、これを除くために未接種の液体培地など
で洗うと良いですが、ほとんどの乳酸菌は洗わなくても問題ありません。旺盛に生育して
いれば、酸が過剰に貯まる前のフレッシュな時点で、集菌して保護液に懸濁する、または
直接グリセロールを加えて懸濁液を調製します。菌量が少ない株は濃縮のために、培養期
間が長くかかる株は蓄積した酸を除くために、集菌する方がおすすめです。
◆Clostridiales目
 偏性嫌気的な培養が必要な菌種は、凍結標品を作製する際にも気相置換した保護液を用
意して密閉容器に小分けして保存します(参考:微生物の保存法(8)絶対嫌気性菌の凍
結保存法)。集菌や標品の調製は、手早く操作してなるべく酸素に暴露する時間を短くす
れば、嫌気ボックスなどを使用せずに通常の大気条件下で操作しても問題ありません。
 通性嫌気的な培養ができる菌種は、偏性嫌気的な培養が必要な菌種と同じように気相置
換した密閉容器で保存するに越したことはありませんが、上述したLactobacillales目と
同じ方法で凍結保存することも出来ます。栄養に富んだ培地で旺盛に生育する株は、旺盛
にガスを発生することが多いので、先にガスだけ抜くなどして開栓時や穿刺の際に菌液が
飛び散らないように注意してください。

※【通性嫌気的な培養】および【偏性嫌気的な培養】は「細菌・アーキアの分類群から見
た培養方法の選び方(1)グラム陽性・低GC細菌(Firmicutes門)前編~気相条件による3
グループへの大別~」をご参照ください。

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 4.NITE講座(後期)のご案内
   生物遺伝資源の産業利用によるバイオ・イノベーション
   ~微生物遺伝資源の産業利用促進~
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 新産業創出・循環型社会の実現のため、革新的なバイオ技術の活用が期待されています。
また、バイオテクノロジーの社会への更なる貢献を目指して、政府において「バイオ・イ
ノベーション戦略」の策定が進められており、2019年夏に公表される予定です。
 NITEでは、生物遺伝資源を活用したバイオ・イノベーションの創出を支えるための環境
整備、技術開発、産業支援等を行っています。この度、政府が進めているバイオ・イノ
ベーション戦略策定の概略および微生物遺伝資源の産業利用促進に向けたNITEの取組を紹
介する講座を開催することとなりました。皆様のご参加を心よりお待ちしております。

○東京会場
 日時:2019年1月31日(木)13:30~17:00
 場所:製品評価技術基盤機構 本所
    東京都渋谷区西原2-49-10

○大阪会場
 日時:2019年2月7日(木)13:30~17:00
 場所:製品評価技術基盤機構 大阪事業所
    大阪府大阪市住之江区南港北1-22-16
 
参加費 :無料
定 員 :各回50名
募集期間:2018年12月3日(月)~2019年1月21日(月)17:00まで

 ※内容の詳細やお申し込み方法につきましては、以下のウェブページをご覧ください。

【詳細】 https://www.nite.go.jp/nbrc/information/2018_bio-kouza2.html

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 5.2018年度MALDI-TOF MS微生物同定ワークショップのご案内
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 MALDI-TOF MSを用いた微生物の迅速同定技術は、遺伝子解析に比べ、迅速かつ簡便で、
安価に解析を行えるという利点があり、医療・衛生現場から食品分野の品質管理まで幅広
く普及しています。
 NBRCでは、これまで多種多様な微生物についてMALDI-TOF MSによる同定を行っておりま
すが、それにより得られた技術やノウハウを皆様にもご活用いただけるよう、以下のとお
りワークショップを行います。皆様のご参加をお待ちしております。

 日  時:1. 2019年2月1日(金)10:40~17:00(ブルカー社製MALDI Biotyperを使用)
      2. 2019年2月8日(金)10:40~17:00(島津製作所社製SARAMISを使用)
 場  所:製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター
      千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
 講習内容:MALDI-TOF MSを用いて微生物同定を行うための、前処理、データ取得、デー
      タ処理(ライブラリーによる同定、バイオマーカー法による同定)を行いま
      す。例えば、NBRCニュース「バイテク分析法(7)MALDI-TOF MSを用いた微
      生物迅速同定法(その2)~実践編~」に記載されている操作を行っていた
      だくイメージです。
 (https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/others/nbrcnews/news_vol52.html#news52_3)
 受講資格:MALDI-TOF MSを利用している方(MALDIデータのみを利用している方含む。)
 募集人数:各回6名(先着順で原則1社から1名までの参加とさせていただきます。)
      なお、参加希望者が3名以下の場合は中止とさせていただきます。
 参加費用:12,000円(テキスト代、消費税を含む。昼食代は含みません。)
 申込方法:以下のウェブページに掲載している申込書をダウンロードしていただき、
      必要事項をご記入のうえ、e-mailまたはfaxでお申し込みください。
 募集開始:2018年12月5日(水)~2019年1月10日(木)正午
      なお、定員になり次第、募集を締め切らせていただきます。

【URL】 https://www.nite.go.jp/nbrc/industry/maldi/workshop.html

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 6.年末年始のNBRC株・DNAリソースの発送休止について
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 NBRCでは下記の期間中、NBRC株・DNAリソースの発送を休止させていただきます。

 発送休止期間:2018年12月21日(金)~ 2019年1月8日(火)

 発送予定:
  12月14日(金)~12月17日(月)まで受付分 → 12月20日(木)発送
  12月18日(火)~12月26日(水)まで受付分 →  1月 9日(水)発送
  12月27日(木)~ 1月 9日(水)まで受付分 →  1月15日(火)発送

 なお、年内の営業日は12月28日(金)まで、年始は1月4日(金)からとなります。

 ※受付件数が多い場合やお送りする菌株の培養に日数がかかる場合には、上記の発送日
  以降になることがございます。

【詳細】 https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/information/holiday_2018.html

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 編集後記
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 今年度から編集長に就任しました。2010年の2月に創刊して以来、いろいろな記事を掲
載してまいりましたが、マンネリ化していないか、編集局の自己満足になっていないか、
読者のみなさまの真の声を聞いてみたくなりました。もし、記事へのご要望やご意見があ
りましたら、以下のNBRCニュース編集局宛にメールをいただけたら幸いです。すべてのご
要望にお応えはできませんが、NBRCニュースをよりよいものにするため、「いいね!」を
もらうため、編集局員一同、記事集めに走りまわります。(KY)

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  レスにご連絡ください。
 ・掲載内容は予告なく変更することがございます。掲載内容を許可なく複製・転載さ
  れることを禁止します。
 ・偶数月の1日(休日の場合はその前後)に配信します。第55号は2019年2月1日に配信
  予定です。

  編集・発行
    独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)バイオテクノロジーセンター
    NBRCニュース編集局(nbrcnews@nite.go.jp)
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